根据各种蛋白酶活性部位的性质可分之为四大类： 丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶。
丝氨酸蛋白酶：其活性中心除丝氨酸外还包括组氨酸和天冬氨酸残基，如胰脏所分泌的各种内肽酶和与凝血、溶血纤维、补体系统有关的各种蛋白酶。
巯基蛋白酶：其活性中心除半胱氨酸外还需有组氨酸残基参与，如植物来源的和细胞溶酶体内的某些组织蛋白酶。
天冬氨酸蛋白酶：它们的活性中心是由两个天冬氨酸残基所组成，如由胃膜分泌的胃蛋白酶、肾脏中的血管紧张素释放酶及细胞溶酶体中的某些组织蛋白酶等。
金属蛋白酶：其活性中心除金属离子外还需有其他氨基酸残基参与，如胰脏羧肽酶的活性中心包括锌离子及谷氨酸、酪氨酸残基。
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